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qPCR反應(yīng)中的Ct值是什么?
點擊次數(shù):93 更新時間:2025-02-25

閾值循環(huán)數(shù) Threshold cycle (Ct) 也寫作Cq值,熒光信號大于熒光閾值時PCR循環(huán)數(shù)。儀器軟件通常將第3-15個循環(huán)的熒光值設(shè)為基線(baseline),是由于測量的偶然誤差引起的。閾值(threshold)一般是基線的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。在實際操作中也可以手動調(diào)節(jié)。高于閾值的熒光信號被認為是真實的信號,用于定義Ct值。Ct會受到閾值的影響,每次試驗由于樣品和儀器的不同會導(dǎo)致基線不同,進而影響閾值和Ct值。

qPCR反應(yīng)中的Ct值是什么?

模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在一定線性關(guān)系,起始模板量濃度越高,Ct值越??;起始模板量濃度越低,Ct值越大。PCR循環(huán)在到達Ct值所在的循環(huán)數(shù)時,剛剛進入真正的指數(shù)擴增期(對數(shù)期),此時微小誤差尚未放大,Ct值的重現(xiàn)性較好,即相同含量的初始模板,得到的Ct值是相對穩(wěn)定的。Ct值不是恒定不變的,可以受到不同樣品、不同儀器的影響,即使相同的樣品在相同的儀器上重復(fù)2遍,Ct值也會存在差異。

1、與Ct值有關(guān)的參數(shù)

標(biāo)準(zhǔn)曲線Standard curve:模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù),縱坐標(biāo)代Ct值。

相關(guān)系數(shù)Correlation coefficient (R^2) :反映了標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性,通常要求>0.99。

擴增效率Efficiency (E):通常要求在90%~110%。效率低于100%,是由于PCR反應(yīng)中存在抑制因素;而高于100%可能一些污染、非特異性擴增或者是引物二聚體造成。

斜率Slope :當(dāng)擴增效率為100%時斜率為-3.32,當(dāng)90%-110%時的斜率為-3.58 ~ -3.10。

2、Ct值與模板拷貝數(shù)的關(guān)系

理想情況下,qPCR的模板經(jīng)過一定的循環(huán)數(shù)進行指數(shù)擴增,擴增循環(huán)數(shù)和產(chǎn)物量之間的關(guān)系是:擴增產(chǎn)物量Cn=起始模板量C1×(1+擴增效率E)^循環(huán)數(shù)n。但是由于E通常無法達到100%,并且在擴增的后期,擴增效率會逐漸降低,只有在理想的情況下才滿足Cn=C1×2^n,即Ct值差1,初始濃度差2倍。

由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系,可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進行定量測定。這是目前的qPCR定量的方法,即用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品與未知濃度樣品同時擴增,將未知濃度樣品的Ct值代入該標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得未知樣品濃度。分析定量時,一般取Ct:15-35。太大或者太小都會導(dǎo)致定量結(jié)果的不準(zhǔn)確。標(biāo)準(zhǔn)曲線需滿足:E:90%~110%,R^2≥0.99,斜率-3.58 ~ -3.10。同時定量標(biāo)準(zhǔn)品的量值需要準(zhǔn)確可靠。用qPCR進行定量,理論上可行,實際上很難獲得準(zhǔn)確的定量結(jié)果。



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